Cum se efectuează o pată Gram

Coloratia Gram este o procedură rapidă utilizată pentru a identifica prezenta bacteriilor in probele de tesut pentru a caracteriza si bacterii, cum ar fi gram-pozitive sau gram-negative pe baza proprietăților chimice și fizice ale pereților celulelor. Această colorare ar trebui aproape întotdeauna să fie făcută ca un prim pas în diagnosticul unei infecții bacteriene.

conținut

Pași
Partea 1pregătirea lamei
Partea 2a face pete gram
Partea 3examinarea rezultatului
Sfaturi
Avertismente
Materiale necesare
Surse și cotatii

Procedura a fost numit după savantul danez Hans Christian Gram (1853 - 1938), care a dezvoltat tehnica în 1882 și publicată în 1884 ca un proces să se facă distincția între două tipuri de bacterii, cu simptome clinice similare: Streptococcus pneumoniae (cunoscut și ca pneumococ) și Klebsiella pneumoniae.

pași

Partea 1
Pregătirea lamei

Pregătește-te pentru muncă în laborator. Puneți mănușile și legați părul lung, pentru a evita contaminarea eșantionului care urmează să fie testat. Dezinfectați un spațiu de lucru sub capota chimică sau în altă zonă bine ventilată și verificați dacă duza Bunsen și microscopul funcționează înainte de a începe.

Sterilizați un diapozitiv de sticlă pentru un microscop. Dacă lama este murdară, spălați-o cu săpun și apă pentru a îndepărta grăsimea și murdăria. Dezinfectați-l folosind etanol, un detergent pentru sticlă sau metoda recomandată de laboratorul dumneavoastră.

Puneți proba pe diapozitiv. Puteți utiliza metoda de colorare Gram pentru a ajuta la identificarea bacteriilor prezente în probele medicale sau culturile bacteriene cultivate pe un vas Petri. Pentru ca metoda să fie utilă, puneți un strat subțire a probei în colorare. Se recomandă utilizarea unui eșantion mai mic de 24 de ore, deoarece bacteriile mai vechi ar putea avea deteriorate pereții celulelor care vor răspunde mai puțin previzibil procesului.

Dacă utilizați un eșantion de țesut, plasați una până la două picături pe diapozitiv și împrăștiați uniform pentru a forma o pată subțire folosind un al doilea slide de sticlă sterilizat. Lăsați să se usuce la aer înainte de a continua.
Dacă se utilizează bacterii într-un vas Petri, se sterilizează bucla de inoculare într-un arzător Bunsen până când strălucește și apoi lasa sa se raceasca. Utilizați pentru a pune o picătură de apă distilată pe lamă și apoi se sterilizează și se usucă mânerul din nou înainte de a transfera un mic eșantion de bacterii și se amestecă ușor în apă.
Bacteriile din bulion trebuie amestecate într-un agitator și apoi adăugate cu o buclă de inoculare, ca mai sus, fără a adăuga mai multă apă.
Dacă aveți o probă de tampon, rotiți ușor tamponul prin lamă.

Fixați petele folosind căldură. Căldura va fixa bacteria pe diapozitiv astfel încât să nu poată fi spălată cu ușurință în timpul colorării. Treceți rapid lama de două sau trei ori prin flacăra unui arzător Bunsen sau încălziți-l peste un încălzitor electric cu lama. Nu exagerați, sau puteți deforma mostrele. Dacă utilizați o duză Bunsen, flacăra ar trebui să fie un mic con, albastru, nu o flacără înaltă, portocalie.

În mod alternativ, pata poate fi fixată prin adăugarea a una sau două picături de metanol în locul uscat, îndepărtând excesul de produs și lăsând să se usuce la aer. Această metodă minimizează deteriorarea celulelor gazdă, oferind un fundal mai curat.

Poziționați lama într-o tavă de colorat. Se compune dintr-o placă mică de metal, sticlă sau plastic, cu un mic suport de ecran sau un fir deasupra capului. Așezați lama pe acest suport astfel încât lichidele pe care le utilizați să se scurgă în tavă.

Dacă nu aveți o tavă de colorare, lama poate fi așezată direct pe o formă de gheață din plastic.

Partea 2
A face pete Gram

Îndepărtați pata cu violet de gențiană. Utilizați o pipetă pentru a înmuia probele de bacterii cu câteva picături de violet de gențiană, denumite uneori violet de cristal sau violet de metil. Așteptați 30 până la 60 de secunde. Violul de gentian disociază în soluții apoase, formând CV + și Cl (Cl-). Acești ioni penetrează peretele și membrana celulelor gram-pozitive și gram-negative. Ionul CV + interacționează cu componentele de încărcare negative ale celulelor bacteriene pentru a le colora în purpuriu.

Multe laboratoare folosesc violet de gențiană cu oxalat de amoniu pentru a preveni precipitarea.

Clătiți ușor violet gentian. Înclinați lama și utilizați o sticlă pentru a arunca apă sau apă distilată peste lamă. Apa trebuie să treacă prin suprafața petei, dar să nu fie aruncată direct peste ea. Nu clătiți prea mult pentru a elimina colorarea bacteriilor gram pozitive.

Îndepărtați pata cu iod și clătiți-o. Utilizați o pipetă pentru a acoperi fața cu iod și lăsați-o să acționeze timp de cel puțin 60 de secunde. Apoi clătiți cu aceeași metodă cu atenție. Iodul sub formă de ioni încărcați negativ, interacționează cu VC + pentru a forma complecși mari de violet de gențiană și iod (complexele CV-I) în straturile interioare și exterioare ale celulei, care deține violet oriunde este.

Iodul este coroziv. Evitați inhalarea, ingerarea sau contactul cu pielea.

Adăugați un înălbitor și clătiți rapid. Un amestec 1 la 1 de acetonă și etanol este utilizat de obicei pentru această etapă critică, care ar trebui să fie programată cu atenție. Țineți lama înclinată și adăugați decolorizatorul până când violetul nu mai este vizibil în lichidul care iese. Procesul durează de obicei 10 secunde sau mai puțin dacă decolorantul conține concentrații mai mari de acetonă. Opriți imediat sau înălbitorul va elimina pata de violetă de gențiană din celulele pozitive și negative, determinând repetarea testului. Clătiți imediat utilizând stadiul tehnicii.

Se poate folosi acetonă pură (> 95%) în locul amestecului. Cu cât este mai multă acetonă, cu atât va acționa mai rapid procesul de înălbire, necesitând un control mai precis al timpului.
Dacă întâmpinați probleme la stabilirea timpului pentru acest pas, luați în considerare adăugarea picăturilor de albire.

Îndepărtați pata cu un colorant de contrast și clătiți-o. Colorantul contrast, de obicei, safranina sau fucsin, este utilizat pentru a adăuga un contrast suplimentar între vopselele Gram-pozitive și Gram-negative decolorat (Gram negativ), de culoare roz sau roșu. Se lasă timp de cel puțin 45 de minute și se clătește.

Fuchsin va pata multe bacterii Gram-negative, cum ar fi haemophilus spp și legionella spp, deci este o opțiune mai bună pentru începători.

Uscați lama. Puteți să-l lăsați să se usuce în vânt sau să-l atingeți folosind hârtie blotată vândută în acest scop. Gramul de gram sa încheiat.

Partea 3
Examinarea rezultatului

Pregătiți microscopul optic. Așezați lama sub microscop. Bacteriile pot varia foarte mult, astfel încât mărirea totală necesară poate varia de la 400x la 1000x. La valori de mărire mai mari, se recomandă utilizarea unei lentile obiectiv imersate în ulei pentru claritate. Puneți o picătură de ulei de înmuiere pe lamă, evitând să faceți prea multe mișcări în timpul aplicării, pentru a preveni formarea de blistere. Mutați revolverul de la microscop astfel încât obiectivul obiectivului să se blocheze în loc prin atingerea uleiului.

Imersia în ulei poate fi utilizată numai pe lentile speciale, nu pe lentile "uscate".

Identificați bacterii gram-pozitive și gram-negative. Examinați diapozitivul sub microscop - bacteriile gram-pozitive vor fi violete datorită violetei de gențiană prinsă în pereții celulelor groase. Gram-negativul va fi roșu sau roz ca violeta a fost spălată prin pereții celulelor subțiri și apoi colorantul de contrast roz a intrat prin ele.

Dacă eșantionul este prea gros, puteți vedea rezultate pozitive false. Dacă toate tipurile de bacterii sunt Gram-pozitive, repetați testul cu un alt eșantion pentru a confirma rezultatul.
Dacă decoloratorul acționează prea mult, puteți vedea negative false. Dacă toate tipurile de bacterii sunt gram-negative, repetați testul cu un alt eșantion pentru a confirma rezultatul.

Căutați imagini de referință. Dacă nu sunteți sigur de apariția unei bacterii, consultați o colecție de imagini de referință organizate de formatul și rezultatul colorării Gram. Puteți găsi o bază de date online pe Baza de date americană a agenților patogeni microbieni, pe Bacteriile în fotografii și multe alte site-uri. Pentru a face mai ușoară identificarea, enumerăm mai jos exemple comune sau importante pentru diagnosticare în funcție de statut și format.

Identificați bacteriile Gram-pozitive după format. Bacteriile sunt clasificate după formatul lor sub microscop, mai frecvent ca cocci (sferici) sau bacili (cilindrici). Iată câteva bacterii comune gram-pozitive organizate de formatul:

Cocci gram-pozitivi acestea sunt de obicei stafilococi (coconi în ciorchini) sau streptococi (nucă de cocos lanț).
Grași bacili gram-pozitivi acestea includ bacil, Clostridium, Corynebacterium și listeria. Bacilii Actinomyces spp. au adesea ramuri sau filamente.

Identificați bacteriile gram-negative. Gram negativ (roz) sunt adesea clasificate în trei grupe: nuci sunt sferice, tijele sunt lungi și subțiri și tije coccoid sunt la mijloc.

Cocci gram-negativi sunt cel mai frecvent Neisseria spp.
Grași bacili negativi acestea includ E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteu, Salmonella, Shigella, Pseudomonas și multe altele. Bacteriile Vibrio cholerae poate să semene cu bacili comune sau curbe.
Gram-negativ bacili coccoid (sau "coccobacilli") acestea includ Bordetella, Brucella, Haemophilus și Pasteurella.

Evaluați rezultatele mixte. Unele bacterii sunt greu de colorat tocmai datorită fragilității sau aspectului ceros al pereților celulari. Acestea pot avea un amestec de colorare purpurie sau roz în aceeași celulă sau între diferite celule ale aceleiași probe. Orice probă de bacterii cu mai mult de 24 de ore ar putea avea această problemă, dar unele specii sunt dificil de culoare la orice vârstă și necesită testarea mai specializate pentru a reduce identificarea, cum ar fi Ziehl-Neelsen pata, observând creșterea culturii, TSI agar sau testul genetic.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium și Propionibacterium spp. sunt toate considerate bacterii gram-pozitive, dar adesea nu pot da rezultate concludente în acest test.
Bacterii mici și fine cum ar fi Treponema, Chlamydia și Rickettsia spp. sunt greu de colorat corect folosind această tehnică.

Scoateți materialele. Procedurile de eliminare a deșeurilor variază în funcție de laborator și de materialele utilizate. În general, lichidul din tava de colorare este aruncat în sticle sigilate ca deșeuri periculoase. Îndepărtați diapozitivele într-o soluție de albire de 10% și apoi aruncați-le în recipiente pentru eliminarea materialelor ascuțite.

sfaturi

Amintiți-vă că rezultatul colorării Gram este la fel de bun ca și proba. Este important să îi învățăm pe pacienți să furnizeze eșantioane bune, arătând, de exemplu, diferența dintre o scuipă și o flegmă mai profundă în probele de spută.
Ca un înălbitor, etanolul acționează mai lent decât acetona.
Respectați măsurile de precauție standard în laborator.
Utilizați un eșantion de tampon pentru a practica, deoarece ar trebui să conțină bacterii gram-pozitive și Gram-negative. Dacă vedeți un singur tip sau celălalt, probabil că utilizați prea multă înălbire sau prea puțin.
Aveți posibilitatea să utilizați un predicator de haine din lemn încărcat cu arcuri pentru a ridica lama.

avertismente

Acetona și etanolul sunt inflamabile, iar primul va elimina uleiurile din mână, făcând pielea să absoarbă mai ușor alte substanțe chimice. Așa că purtați mănuși și fiți atenți.
Nu lăsați proba să se usuce înainte să clătiți pata sau contra pata.